SuperSep Phos-tag™ 蛋白磷酸化预制胶-免费试用装(活动结束)


  SuperSep Phos-tag™是研究蛋白磷酸化的方法,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。


SuperSep Phos-tag™


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  Phos-tag™是一种预制胶,预先加入了50 μmol/L的Phostag™ Acrylamide,打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子,在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好,得到的带条结果也很整齐。

  磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

  分离后,胶可用于考马斯亮蓝染色,免疫印迹和质谱实验。


Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理


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在HighWire Search 上搜索到的论文数


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运用


利用p35的丙氨酸突变体确定Cdk5 激活p35的磷酸化位点


  p35常见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位点往往会发生丙氨酸突变,产生3种突变体(Ser8突变体:S8A,Thr138突变体:T138A,Ser8和Thr138双突变体:2A)。这3种突变体、野生型p35、Cdk5和没有激酶活性的Cdk5都来源于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE和Western blotting 进行检测(检测抗体:p35抗体)。


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100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系!


- 泳道1(条带L2和L4)和泳道5(条带M1):p35在Cdk5的作用下发生了磷酸化;

- 泳道1(条带L2和L4)和泳道3(条带L2和L4):在无激酶活性Cdk5的作用下,大约有一半p35蛋白在Thr138位点

          发生磷酸化,同样在138位发生突变的p35蛋白亦是如此。

泳道5 (条带M1)和泳道6(条带L3和L4):Ser8和Thr138是主要的磷酸化位点;

- 泳道5(条带M1)、泳道7(条带L1和L2)和泳道8(条带M2):条带M1是Ser8和Thr138都发生磷酸化的条带;

           条带M2是只有Ser8磷酸化的条带;条带L1和L2是只有Thr138磷酸化的条带。

※ 条带L1和L3中的X 是不确定哪个位点发生磷酸化的条带;

※ 条带L4是非磷酸化的p35。


【参考文献】

Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T.

Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【结果提供】

理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永(Dr. T. Hosokawa)

首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)


检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片段


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我们可以确定在片段中含有目的激酶!


① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1(1-290)结合蛋白

② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1(1-290)作为体外激酶实验的反应底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting,确定迁移条带中每个片段的激酶活性


【参考文献】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase

1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike,

and I. Kameshita, Biochem. J.,

【结果提供】

高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪(Dr. Y. Sugiyama)

香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇(Dr. I. Kameshita)



二维电泳中的应用:分析hnRNP K磷酸化异构体


  小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后,裂解细胞,经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中,一维是IPG 胶,二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE,可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪,可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。


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同一个等电点的位置上,不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)


【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity

electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara,

Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)

理化学研究所RCAI 小原收



备注


样品制备:

Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感,尤其是螯合剂,钒酸,无机盐,表面活性剂这类物质。

强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。


转膜前处理:

另一个必须的步骤是在转膜前,用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或者Zn2+);

该步骤可提高蛋白的转膜效率。

● 分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。

● 将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,至少20分钟,温和摇晃。更换新缓冲液,重复3次。

● 将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,10分钟,温和摇晃。

● 转膜操作*。

* 建议用湿法转膜,以提高转膜效率。


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质量控制


  每一批SuperSep Phos-tag™,出厂前均根据其亚博直播下载规格进行测试,以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白,以及他们的分离成都在正常参数内。


◆亚博直播下载信息


亚博直播下载编号
亚博直播下载名称
规格
192-18001-EA-S

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm

Phos-tag 预制胶50μmol/l,7.5%,17孔,Life Technologies型

1块
198-17981-EA-S

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm

Phos-tag 预制胶50μmol/l,7.5%,17孔,BioRad型

1块


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活动已结束




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